Το WB δεν λειτουργεί καλά; Λίγες ή λείπουν συγκροτήματα; Η μέθοδος εκχύλισης δείγματος μπορεί να είναι το πρόβλημα!
Χρησιμοποιώντας το κολλαγόνο, το οποίο είναι δύσκολο να εξαχθεί, ως παράδειγμα, ας αντιμετωπίσουμε το πείραμα WB μαζί!
Το κολλαγόνο είναι αδιάλυτο σε κρύο νερό και οργανικούς διαλύτες. Επομένως, οι συμβατικές μέθοδοι λύσης ιστού/κυττάρων δεν είναι αποτελεσματικές για την εξαγωγή κολλαγόνου. Εδώ συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε τη μέθοδο εξαγωγής θερμότητας SDS για το κολλαγόνο, η οποία είναι βολική, γρήγορη και εξαιρετικά αποδοτική.
▇ Σύσταση εκχύλισης δείγματος - Μέθοδος εξαγωγής SDS
1 για τη δειγματοληψία των ζώων, ολοκληρώστε τη διαδικασία εντός 5 λεπτών. Μετά την ανατομή, ξεπλύνετε απαλά τον ιστόπρο-ψύχθηκε PBS (G2156)Για να αφαιρέσετε το αίμα της επιφάνειας μέχρι να καθαρίσετε. Χρησιμοποιήστε το φίλτρο χαρτιού για να απορροφήσετε το περίσσειο υγρού και στη συνέχεια τοποθετήστε αμέσως το δείγμα σε έναEP Tube ή κρυογονικά φιαλίδια (CV -3)και αποθηκεύστε το -80. Για μεταφορά, μεταφέρετε γρήγορα το δείγμα σε απεριβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας (ξηρός πάγος)για συντήρηση και αποστολή.
2. Κόψτε ένα100mgδείγμα ιστού σε κομμάτια και τοποθετήστε το σε έναΣωλήνας λείανσης 2ml(Ht -200- m). Προσθέτω10 × όγκος (1ml) του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης RIPA (ισχυρή) (G2002), προ-αναμεμειγμένο μεΚοκτέιλ (G2006), Αναστολέας φωσφοπρωτεάσης (G2007),PMSF (G2008). Προσθέτω2 τεμάχια από χάντρες λείανσης ζιρκονίας 4mm. Δεδομένου ότι το κολλαγόνο είναι ευαίσθητο στη θερμοκρασία, πρέπει να εκτελεστεί εκχύλισησε πάγο σε 4 μοίρεςγια να αποφευχθεί η υποβάθμιση του κολλαγόνου λόγω της εκκαθάρισης της τριπλής έλικας.
3. Τοποθετήστε το σωλήνα λείανσης στοΟμολογητής χαμηλής θερμοκρασίας (SWE-FP)για επεξεργασία. Ρυθμίστε τις παραμέτρους λείανσης4 βαθμοί, 70Hz, για τη δεκαετία του '60. Για σκληρότερα δείγματα όπως το δέρμα, επαναλάβετε την ομογενοποίηση πολλές φορές στιςΔιαστήματα 20Sγια να επιτευχθεί βέλτιστα αποτελέσματα.
4. Μετά την άλεση, προσθέστε αμέσωςΔιάλυμα 10% SDS (G2055)Για να ρυθμίσετε την τελική συγκέντρωση SDS σε4%με βάση τον όγκο ομογενοποίησης. Ανακατέψτε καλά, στη συνέχεια θερμαίνετε σε έναξηρό λουτρό (SMB-H) σε 90 μοίρες για 15 λεπτά.
5. Φυγοκεντρίστε το λύνος στο12, 000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Συλλέξτε το υπερκείμενο, διατηρώντας ένα τμήμα γιαΠοσοτικό κιτ ανίχνευσης πρωτεΐνης BCA (G2026)για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της εκχύλισης πρωτεϊνών.
6. Ανακατέψτε το υπερκείμενο πρωτεΐνηςBuffer 5 × Φόρτωση (G2075)σε αναλογία 4: 1 και μετρώ95 βαθμοί για 15 λεπτάσε ξηρό λουτρό.
(Οι αριθμοί καταλόγων προϊόντων που χρησιμοποιούνται παραπάνω είναι όλοι από τη μάρκα ServiceBio.)
▇ Συνιστώμενες πειραματικές συνθήκες
1. Προετοιμασία πηκτής:Χρησιμοποιήστε το 15- λεπτόΈνα βήμα Fastcast πολύχρωμα κιτ ακρυλαμιδίου (6%) (G2175).
2. Ηλεκτροφόρηση:Χρήσητυποποιημένο ρυθμιστικό ηλεκτροφόρησης (G2144). Εκτελέστε το πήκτωμα στοίβαξης στο90V για 30 λεπτάΜέχρι να εισέλθει στο πηκτό επίλυσης. Ρυθμίστε την τάση σε120Vκαι συνεχίστε την ηλεκτροφόρηση μέχρι το μπλε βρωμοφαινόλη να φτάσει 1 cm από το κάτω μέρος της γυάλινης πλάκας, στη συνέχεια να σταματήσει την ηλεκτροφόρηση.
3. Μεταφορά:ΧρήσηΠεριόριστη γρήγορης μεταφοράς (G2148)για γρήγορη μεταφορά χωρίς πάγο, στο300 mA για 40-60 λεπτά.
4.Αποκλεισμός: Αποκλεισμός με5% αποβουτυρωμένο γάλα (GC310001), επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα.
5. Επώαση πρωτογενούς αντισωμάτων:Επώαση εν μία νυκτί στο4 μοίρες σε ένα Shaker (DS -3 D100).
6. Επώαση δευτερογενούς αντισωμάτων:Επωάζωθερμοκρασία δωματίου σε ένα Shaker (DS -3 D100)για 1 ώρα.
7. Χημειοφωταύγεια:ΧρήσηΑντιδραστήριο ανίχνευσης ECL (G2161, ένας συνδυασμός σετ με διαφορετικές ευαισθησίες κατάλληλες για όλες τις συγκεντρώσεις πρωτεϊνών από χαμηλό σε υψηλό, μειώνοντας την υπερέκθεση και τη βελτίωση των ποσοστών επιτυχίας).
8. Απεικόνιση χημειοφωταύγειας:Εκτελέστε απεικόνιση χημειοφωταύγειας (SCG-W3000συνιστάται, ικανή να εκθέσει τόσο τα αδύναμα όσο και τα ισχυρά σήματα σε μία έκθεση).
(Οι αριθμοί καταλόγων προϊόντων που χρησιμοποιούνται παραπάνω είναι όλοι από τη μάρκα ServiceBio.)
▇ Σύγκριση της μεθόδου εκχύλισης SDS έναντι των αποτελεσμάτων της μεθόδου εκχύλισης τυπικής μεθόδου εκχύλισης
1. Όχι.: GB114197
Λωρίδα 1: λύση ιστών δέρματος ποντικιού
Προβλεπόμενο μέγεθος ζώνης: 139 kda
Λωρίδα 2: Λύση ιστού δέρματος ποντικιού (μέθοδος εξαγωγής SDS)
Ανιχνευμένο μέγεθος ζώνης: 120-140 kda
Λωρίδα 3: Λυστάς ιστών δέρματος αρουραίου
Λωρίδα 4: Λυστάς ιστών δέρματος αρουραίου (μέθοδος εκχύλισης SDS)
▇ Σύγκριση της μεθόδου εκχύλισης SDS έναντι των αποτελεσμάτων της μεθόδου εκχύλισης τυπικής μεθόδου εκχύλισης
2. Cat. Όχι.: GB11022
Λωρίδα 1: Λύση ιστού δέρματος ποντικιού (μέθοδος εκχύλισης RIPA)
Λωρίδα 2: Λυστάς ιστών δέρματος αρουραίου (μέθοδος εκχύλισης RIPA)
Λωρίδα 3: Λυστάς ιστού δέρματος ποντικιού (μέθοδος εξαγωγής SDS)
Λωρίδα 4: Λυστάς ιστών δέρματος αρουραίου (μέθοδος εκχύλισης SDS)
Τα αντισώματα ελέγχου φόρτωσης είναι απαραίτητα για τα πειράματα WB.
